納米結(jié)構(gòu)的微電極以及集成所述微電極的生物傳感器件的制作方法
【專利說明】納米結(jié)構(gòu)的微電極從及集成所述微電極的生物傳感器件
[0001 ] 本申請(qǐng)為分案申請(qǐng)，原申請(qǐng)的申請(qǐng)日為2009年9月1日，申請(qǐng)?zhí)枮?00980143689.0 (PCT/CA2009/001212)，發(fā)明名稱為"納米結(jié)構(gòu)的微電極W及集成所述微電極的生物傳感器 件'。
[000^ 相關(guān)申請(qǐng)
[0003] 本申請(qǐng)要求保護(hù)于2008年9月5日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/093,667(名稱:納米 結(jié)構(gòu)微電極W及集成所述微電極的生物傳感器件(化nostructured Microelectrodes and Biosensing Devices Inco;rporating the Same))的優(yōu)先權(quán)，該申請(qǐng)通過引用W其整體結(jié) 合到本文中。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 基因組分析徹底革新了早期疾病診斷并顯著增強(qiáng)了對(duì)患者的護(hù)理(McGuire等 .Science 317 :1687 , Srinivas等，Lancet Oncol. 2: 698)。微陣列（Drmanac等，Science 260 :1649 ,Hacia等，Nat. Genet. 14:441)和基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)的技術(shù)（Saiki等， Science 230:1350)作為工具，有助于引領(lǐng)運(yùn)場(chǎng)革新，使得能夠發(fā)現(xiàn)并初步開發(fā)用于患者測(cè) 試的測(cè)定法(Morr i S等,化rr .Op in.化col.19:547)。然而，將基因組學(xué)革新的范圍擴(kuò)展到患 者床邊需要用于個(gè)體生物標(biāo)志概況分析的成本有效的工具，所述個(gè)體生物標(biāo)志概況分析相 對(duì)于假定疾病狀態(tài)進(jìn)行評(píng)價(jià)。具體地講，優(yōu)選能夠常規(guī)患者護(hù)理的工具會(huì)比基于PCR的方法 更簡(jiǎn)單、更輕便和更便宜，但應(yīng)保持高度的選擇性和靈敏度。
[0006] 基于電子讀出（electronic readout)的生物標(biāo)志分析早已作為有希望的方法提 及，該方法能使基于忍片的器件的新家族W合適成本和靈敏度用于醫(yī)學(xué)測(cè)試化rummond等， 化t .Biotechnol. 21:1192 ,Katz等，Electroanalysis 15:913)。電子讀出的靈敏度在原則 上足W允許用簡(jiǎn)單儀器裝置就可直接檢測(cè)少量分析物分子。然而，盡管在該領(lǐng)域和設(shè)及新 診斷學(xué)的相關(guān)領(lǐng)域都取得了巨大進(jìn)展（Clack等，Nat. Biotechnol .26:825, Geiss等， 化t.Biotechnol.26:317,Hahm等，Nano Lett.4:51, Munge等，Anal.畑em.77:4662, Nicewarner-Pena等，Science 294:137,Park等，Science 295:1503,Sinensky等， Nat.Nano.2:653,Steemers等，Nat.Biotechno1.18:91,Xiao等，J.Am.畑em.Soc.129: 11896,Zhang等，Nat.Nano.1:214,Zhang等，Anal.Chem.76:4093,Yi等， Biosens.Bioelectron.20:1320,Ke等，Science 319:180,Armani等，Science317:783)，但 是目前多路復(fù)用忍片(multiplexed chip)仍然必須實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞樣品和臨床樣品的生物標(biāo) 志進(jìn)行直接電子檢測(cè)。限制運(yùn)類器件實(shí)施的挑戰(zhàn)主要來自在當(dāng)測(cè)定復(fù)雜生物樣品時(shí)存在的 高背景噪聲水平存在下獲取非常低的檢測(cè)限的困難，W及產(chǎn)生具有高度靈敏性和特異性的 多路復(fù)用系統(tǒng)的挑戰(zhàn)。
[0007] 電化學(xué)系統(tǒng)的小型化一直是分析化學(xué)和生物分析化學(xué)中的主要焦點(diǎn)(Matysik, Miniaturization of Electroanalytical Systems(Springer-Verlag, 2002))，因?yàn)橛镁?有微米級(jí)至納米級(jí)尺寸的系統(tǒng)可能能夠達(dá)到提高靈敏度(Szamocki等，A.Anal.化em. 2007， 79,533-539)。已用微米級(jí)或亞微米級(jí)尺寸的電極進(jìn)行了大量工作。運(yùn)些系統(tǒng)具有許多超出 常規(guī)大電極的優(yōu)勢(shì)，例如雙層充電更快、歐姆損耗降低、傳質(zhì)速率高和電流密度高(Bond等 Anal.Chimi.Acta 1989m 216，177-230,Heinze,Angew.Chem.Int.Ed.2003，32，1268-1 288 ) D實(shí)際上，這樣的電極已經(jīng)成為各種分析應(yīng)用中的充分確立工具（Bard, Electrochemical Methods:Fundamentals and Applications(Wiley,New York,2001)， 民eimers,Chem.民ev.2007,107,590-600,Zosic,Handbook of electrochemistry 化lsevier，2007))。然而，采用納米級(jí)電極的工作明顯更具挑戰(zhàn)性，因?yàn)橹谱魍ǔＪ莿趧?dòng)密 集型的、重現(xiàn)性差，而且由運(yùn)類結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的電流通常難W進(jìn)行精確測(cè)量。
[000引已經(jīng)研究了納米線電極(nanowire elec化ode)在超靈敏的核酸和蛋白質(zhì)檢測(cè)中 的應(yīng)用(Gasparac等JAm化em Soc 126:12270)。運(yùn)種電極平臺(tái)的應(yīng)用使得能夠電化學(xué)檢測(cè) 皮摩爾水平的分析物，而運(yùn)種靈敏度水平用大尺度材料是無法達(dá)到的。盡管已經(jīng)報(bào)道了納 米線能夠檢測(cè)渺摩爾(attomolar)水平的分析物，但是當(dāng)處理通常用于分析的體積時(shí)，運(yùn) 實(shí)際上相當(dāng)于皮摩爾水平。也已經(jīng)證明了納米粒改性的電極可W表現(xiàn)出超出常規(guī)大電極的 若干優(yōu)勢(shì)，例如傳質(zhì)的增強(qiáng)、催化作用、高的有效表面積和對(duì)電極微環(huán)境的控制化atz等 Electroanalysis 2004，16，19-44,Welch等Anal.Bioanal.Chem.2006，384,601-619)。然 而，制備納米線電極陣列非同小可。
[0009] 通過銷納米粒的電沉積改性的棚滲雜的金剛石微電極已經(jīng)用于對(duì)低于Ippb水平 的As(III)的氧化測(cè)定(化apovic等Anal.化em. 2007,79,500-507)。然而，運(yùn)類電極不能集 成到用于多元實(shí)驗(yàn)的基于陣列的格式中。
[0010] 對(duì)核酸生物標(biāo)志組或蛋白質(zhì)生物標(biāo)志組的分析為作出臨床決策提供了有價(jià)值的 診斷和預(yù)后信息。向?qū)εR床樣品進(jìn)行概況分析提供特異性和靈敏度的現(xiàn)有方法通常是昂 貴、緩慢和連續(xù)的。因此需要超靈敏的器件，用于W多元方式檢測(cè)生物標(biāo)志。
[00川發(fā)明概述
[0012] -方面，本發(fā)明的特征在于納米結(jié)構(gòu)微電極(NMEKNME是電極，它具有納米質(zhì)地， 因此具有增加的表面積。優(yōu)選的NME由W下構(gòu)成:貴金屬(例如金、銷、鈕、銀、餓、銅、錠、釘）； 貴金屬合金(例如金-鈕、銀-銷等）；導(dǎo)電聚合物(例如聚化咯(PPY));非貴金屬(例如銅、儀、 侶、錫、鐵、銅、鶴、銷）；金屬氧化物(例如氧化鋒、氧化錫、氧化儀、氧化錫銅、氧化鐵、氮滲雜 的氧化鐵(TiOxNy);金屬娃化物(娃化儀、娃化銷）；金屬氮化物(氮化鐵(TiN)、氮化鶴(WN) 或氮化粗(TaN));碳(納米管、纖維、石墨締和無定形物)或任何W上材料的組合。上述材料 的NME是高度導(dǎo)電的并與探測(cè)物(例如核酸和膚)形成強(qiáng)的鍵。優(yōu)選的NME具有約0.5-約100 微米(皿)范圍的高度，例如約5-約20微米(例如10微米)范圍的高度;約1-約10微米范圍的 直徑;并具有納米級(jí)的形態(tài)(例如在約1-約300納米和更優(yōu)選范圍為約10-約20納米的長(zhǎng)度 尺度上為納米結(jié)構(gòu)的）dNME可W是任何不同形狀，包括半球形、不規(guī)則形(例如釘狀）、環(huán)形 (線狀)或分形(fractal)(例如樹枝狀KNME的表面還可用材料包被，該材料維持電極的高 電導(dǎo)率，但促進(jìn)與探測(cè)物結(jié)合。例如，含氮NME(例如TiN、WN或TaN)可與探測(cè)物的胺官能團(tuán)結(jié) 合。同樣，作為NME的部分的娃/二氧化娃化學(xué)（Silicon/siIica chemistry)可與探測(cè)物上 的硅烷或娃氧烷基團(tuán)結(jié)合。
[0013] 另一方面，本發(fā)明的特征在于與探測(cè)物締合的NME。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述探測(cè) 物是核酸(例如核糖核酸(RNA)、脫氧核糖核酸(DNA)或其類似物，包括例如膚核酸(PM)(其 含有由通過膚而不是脫氧核糖或核糖連接的N-(2-氨基乙基)-甘氨酸單元組成的骨架）、膚 核酸、鎖定核酸或憐酷二胺嗎嘟代寡聚物（phosphorodiamidate mor地olino oligomer)。 在合適條件下，所述探測(cè)物可W與互補(bǔ)核酸雜交，W提供樣品中核酸存在的指示。在另一個(gè) 實(shí)施方案中，所述探測(cè)物是能夠與生物標(biāo)志祀標(biāo)(例如受體或配體)結(jié)合或W其它方式與之 相互作用的膚或蛋白質(zhì)（例如抗體），W提供樣品中配體或受體存在的指示。所述探測(cè)物可 包含促進(jìn)與NME結(jié)合的官能團(tuán)（例如硫醇、二硫酪、胺、簇酸）。探測(cè)物也可含有其它特征，例 如縱向間隔物、雙鏈區(qū)和/或單鏈區(qū)、聚T接頭、作為剛性接頭的雙鏈雙鏈體和PEG間隔物。
[0014] 又一方面，本發(fā)明的特征在于在基材上陣列的多個(gè)NME。優(yōu)選的基材由例如W下半 導(dǎo)體材料構(gòu)成:娃、二氧化娃、石英、錯(cuò)、神化嫁、碳化娃和銅化合物(例如神化銅、錬化銅和 憐化銅）、硫化砸、陶瓷、玻璃、塑料、聚碳酸醋或其它聚合物或任何上述材料的組合?；目?任選包括純化層，其由提供高阻抗并維持小的活性表面積的材料構(gòu)成。合適材料的實(shí)例包 括:二氧化娃、氮化娃、氮滲雜的氧化娃(SiOxNy)或聚對(duì)二甲苯(paralyene)。在某些實(shí)施方 案中，在基材上陣列的多個(gè)NME包括與單層間隔物連接的探測(cè)物，所述間隔物使探測(cè)物密度 最小化，從而使配位效率最大化。優(yōu)選的單層間隔物具有對(duì)金屬的親和力并且可由例如W 下組成:硫醇(例如琉基己醇、燒控硫醇、半脫氨酸、脫胺、硫醇胺、芳族硫酪(例如苯硫酪、二 硫酪)）、麟酸或次麟酸。
[0015] 另一方面的特征在于生物傳感器件，例如集成電路，其包括例如基材;在所述基材 上的導(dǎo)電的導(dǎo)線;覆蓋所述導(dǎo)線的絕緣層或純化層，所述絕緣層具有暴露部分導(dǎo)線的孔隙； W及與導(dǎo)線的暴露部分電相通的納米結(jié)構(gòu)微電極，所述微電極適于響應(yīng)生物分子刺激(例 如核酸雜交或蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的結(jié)合)而產(chǎn)生電荷。
[0016] 再一方面，本發(fā)明的特征在于NME的制備方法。使用電沉積W從NME巧晶生長(zhǎng)出納 米結(jié)構(gòu)微電極，允許運(yùn)些結(jié)構(gòu)的大小和形態(tài)可W被精細(xì)控制，并允許由一種或多種物質(zhì)構(gòu) 成的電極的通用制作?？稍谏飩鞲衅骷侠鏦基于忍片的格式來制備NME，使得一系列 NME都可制備在單個(gè)忍片上，從而能夠進(jìn)行多元實(shí)驗(yàn)。該NME系統(tǒng)可為特別有用和通用的，允 許調(diào)節(jié)若干參數(shù)，包括:對(duì)NME大小和形狀的微米級(jí)控制、對(duì)NME納米質(zhì)地的納米級(jí)控制、W 及對(duì)NME材料的選擇。
[0017] 還一方面的特征在于具有納米結(jié)構(gòu)微電極的生物傳感器件的制備方法。例如，所 述方法可包括W下步驟:提供基材和在所述基材上導(dǎo)電的導(dǎo)線，所述導(dǎo)線被絕緣層覆蓋;在 所述絕緣層中蝕刻孔隙W暴露部分導(dǎo)線;和將導(dǎo)電材料電沉積在所述導(dǎo)線的暴露部分上， 形成如上所述的納米結(jié)構(gòu)微電極。
[001引另一方面，提供生物傳感盒(biosensing cartridge)，其包括：用于包含生物樣品 的樣品室；用于包含如上所述的生物傳感器件并進(jìn)行生物傳感過程的生物傳感室。
[0019] 還一方面，提供生物傳感工作站，其包括:用于固定如上所述的生物傳感盒的盒固 定器；用于進(jìn)入所述生物傳感盒的儀器尖端（ins化ument tip);用于選擇待進(jìn)行的生物傳 感過程的選擇機(jī)構(gòu);適于使用生物傳感盒來進(jìn)行生物傳感過程并根據(jù)所述生物傳感盒產(chǎn)生 的電子信號(hào)來確定所述生物傳感過程的結(jié)果的處理器;和用于顯示所述生物傳感過程的結(jié) 果的顯不器。
[0020] 又一方面的特征在于使用集成在如上所述的器件中的含有探測(cè)物的納米結(jié)構(gòu)微 電極來進(jìn)行生物傳感過程的方法;相對(duì)于參比電極為所述微電極提供偏置;測(cè)定所述微電 極與所述參比電極之間的參比電荷或參比電流;將所述微電極暴露至生物分子刺激(例如 核酸探測(cè)物與互補(bǔ)核酸之間的雜交或膚探測(cè)物與生物樣品中存在的結(jié)合配偶體之間的結(jié) 合）；測(cè)定響應(yīng)于所述生物分子刺激在所述微電極中產(chǎn)生的電荷或電流;然后通過將所測(cè)電 荷或所測(cè)電流針對(duì)所述參比電荷或參比電流進(jìn)行比較，確定所存在的生物分子刺激的量。
[0021] NME是通用的、穩(wěn)健的并且易于使用。另外，它們可用用于頂端金屬(top-metal)制 作的現(xiàn)有娃CMOS鑄造廠制作工藝或其簡(jiǎn)單外延工藝來制備，例如經(jīng)無電沉積或電沉積在來 自CMOS鑄造廠的頂端金屬層上，允許制備容易整合到現(xiàn)有生產(chǎn)設(shè)備上的NME。另外，NME能夠 與探測(cè)分子穩(wěn)定連接。此外，NME促進(jìn)即時(shí)接近祀分子，使得當(dāng)與連接NME的探測(cè)分子互補(bǔ)的 祀分子進(jìn)入所述探測(cè)物附近時(shí)，高概率地發(fā)生雜交或蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的結(jié)合。NME還與在雜 交事件讀出中所用的電催化電化學(xué)的性能相容。
[0022] 根據(jù)W下詳述和權(quán)利要求書，本文所公開的本發(fā)明的其它特征和優(yōu)勢(shì)將會(huì)是顯而 易見的。
[0023] 附圖簡(jiǎn)述
[0024] 圖I(A)是匪E生物傳感器件的示意圖；圖I(B)是用于形成匪E的孔隙的剖視示意 圖；圖I(C)是孔隙中NME形成的示意圖；
[0025] 圖2是NME生物傳感器件的示意圖；
[0026] 圖3是具有